測序,法醫分析和遺傳分析

發布日期:2016-10-19 10:09:13

內容

介紹

21世紀初在我們的各種生物,最顯著的例子是人類基因組測序的DNA序列的認識經歷了一場革命。基因組DNA的分析使我們了解進化了很多,而DNA序列中隱藏的語言不同生物之間的關系,由基因控制的機制,對疾病的易感性。整個基因組的測序是尚未然而,常規技術中,和遺傳分析的其它方法用于快速和有效地分析DNA樣本。這些方法和技術,如DNA指紋圖譜,也改變法醫學。

DNA測序,基因和取證分析所有的已建立的方法依賴于使用標記的寡核苷酸和/或脫氧或雙脫氧三磷酸核苷,和需要的DNA聚合步驟。這可以是聚合酶鏈反應(在遺傳分析STR分析),單核苷酸延伸(微型測序SNP分析),或聚合和DNA鏈終止(的組合Sanger測序)。

聚合酶鏈反應(PCR)

聚合酶鏈反應(PCR)是在分子生物學,診斷學,法醫學和分子遺傳學廣泛使用,以擴增一個特定區域(一個技術擴增子的DNA樣品的)。PCR可以放大珍貴的DNA樣本(如在犯罪現場)的幾個分子產生大量的DNA,從50到長度超過25 000個堿基對。

在PCR中,兩個短寡核苷酸(PCR引物)的設計,使得每個互補于在該區域的兩個靶鏈之一的3'-端待擴增:兩個PCR引物限定的擴增子。由引物結合模板的區域中的一系列的循環(擴增圖1)。PCR需要的DNA聚合酶。而所有生物體含有DNA聚合酶,即在PCR中使用的聚合酶來自嗜熱菌棲熱菌屬aquaticusTaq聚合酶是耐熱的,這意味著高達95℃的溫度下可在PCR中使用,低的條件DNA雙鏈體的穩定性

聚合酶鏈反應(PCR)

圖1 | 的聚合酶鏈反應(PCR)

在第一周期中,雙鏈靶被分離成通過加熱兩個單模板鏈至95℃。然后將其冷卻至55℃,以允許合成的寡核苷酸引物退火到模板鏈與它們的3'端彼此相對。然后將溫度升高到72℃,對于熱穩定的Taq DNA聚合酶的活性最適溫度。聚合酶使用脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs濃度),以引物沿著生產的DNA兩個新的雙鏈(模板的長度延伸。圖2)。

PCR循環

圖2 | PCR循環的聚合酶鏈式反應的單個周期。

PCR的第二周期是第一周期的重復,并且每個新合成的單鏈也可以作為引物退火和延伸的模板。聚合酶只能盡可能延長DNA作為第一引物的位點,產生特定長度的DNA雙鏈體。在所有的后續周期的擴增產生的PCR產物由兩個引物的位點特定的長度,而這些PCR產物很快多于原本的目標分子。在理論上,Ñ的PCR循環將產生2 Ñ PCR產物。

由凱利·穆利斯20世紀80年代發明的,聚合酶鏈反應已是穆利斯被授予了分子生物學,DNA診斷和法醫學這樣一個無處不在的影響諾貝爾獎

引物二聚體的形成

不正確的擴增子在PCR中有時產生由于引物二聚體形成,其中,所述PCR引物雜交,和被放大的代替模板DNA(圖3)。引物二聚體是最有可能以在PCR擴增開始時,當引物中存在的高濃度相對于模板。引物二聚體formatin可發生即使有幾個錯配的引物-二聚體雙鏈體,其由結合于Taq聚合酶穩定。引物二聚體的形成是當幾個PCR反應在同一個管(多重PCR)進行了一個特別的問題。

引物二聚體的形成

圖3 | 引物二聚體形成的,而不是DNA模板擴增的形成與引物二聚體的擴增,可以對PCR產生不利影響。

在減少引物二聚體形成明顯的步驟是,使它們具有低的自身互補來設計引物,但是這并不總是可能的,并且可能會導致引物二聚體的擴增甚至弱相互作用。“熱啟動”PCR技術已經發展到減輕引物二聚體的形成。在熱啟動PCR反應混合物最初缺少的重要組成部分,如Taq聚合酶,或Mg 2+(其中Taq聚合酶需要活性)。在第一周期開始長時間加熱確保了所有的引物二聚體的變性,則該缺失的組件添加。PCR現在可以繼續正常。該技術的主要缺點是污染的加入必須成分的,以打開反應管中的可能性。一個替代方法包括,關于加熱解離的使用Taq聚合酶的非共價抑制劑(例如肽或抗體)。在另一方法中,PCR反應的一個重要組成部分是封閉在一個蠟丸,熔化在加熱時,釋放其內容。

DNA測序

所有這一切,因為在30年前由弗雷德·桑格在劍橋制定的方法是不可能的。桑格制定了關于他被授予他的第二個DNA測序(雙脫氧法)的新方法諾貝爾文學獎,1980年。

桑格(雙脫氧)DNA測序

桑格的DNA測序的雙脫氧方法是常規地用于在實驗室中的DNA測序的第一個方法。以下組件所需的Sanger測序:

  • DNA模板進行測序
  • 在5'端標記的與寡核苷酸引物32 P
  • DNA測序聚合酶
  • 四脫氧核苷三磷酸:的dATP,dGTP,的dCTP,dTTP的
  • 四脫氧三磷酸核苷(缺少2'-和3'-羥基的三磷酸核苷):的ddATP,的ddGTP,ddCTP的,ddTTP(圖4

桑格測序是一個修改形式的DNA復制引物雜交到模板的特定位點與聚合酶結合,并結合核苷酸組裝模板的反向互補拷貝。這一過程將不提供在模板上的序列和用于此目的4測序反應在分開的試管中進行的任何信息。在每個管中的關鍵成分的少量,2',3'-二脫氧核苷三磷酸的溶液。雙脫氧三磷酸核苷的ddATP加入到管1,的ddGTP至管2的ddCTP至管3和ddTTP到管4。

雙脫氧核苷酸triphosphoates的結構(的ddNTPs)

圖4 | 雙脫氧核苷酸triphosphoates的結構(的ddNTPs)

該聚合酶不三磷酸脫氧核苷(dNTPs濃度)和雙脫氧核苷三磷酸(的ddNTPs)區分,所以要么可以在每個步驟中添加。如果添加dNTP的是,DNA鏈將繼續增長; 如果加入的ddNTP,則該DNA鏈將終止,因為它沒有3'-羥基基團,以與傳入核苷三磷酸的反應:沒有進一步的核苷可以增加。在每個管的結果是不同長度的寡核苷酸,都端接一個特定的ddNTP的混合物在管1的所有終端將在A,在管2在G,在管3中C,并在管4在T該寡聚物可然后根據其大小通過電泳進行分離。如果所有四個梯子上的聚丙烯酰胺凝膠上并排,并且凝膠暴露于照相膠片,所述32 P標記的片段將產生可用于讀取DNA序列(其將是反向的圖像模板的補體)(圖5)。在實踐中有可能通過該方法測序周圍的DNA的300個堿基。

桑格(雙脫氧)測序

圖5 | 桑格(雙脫氧)測序

基于熒光二脫氧DNA測序

在Sanger測序的自動化高通量熒光版本,未標記的寡核苷酸引物使用,具有耐熱性DNA聚合酶,四正常的脫氧核苷三磷酸,和具有四個雙脫氧三磷酸核苷沿不同的熒光標記上它們(圖6)。

現在只有1測序反應是必要的,因為終止在的ddA使DNA片段的特定原子熒光顏色,子ddG不同的顏色,DDC第三顏色和DDT的第四顏色。所述熒光染料的性質取決于所使用的DNA序列,但基本要求為四染料具有良好分辨熒光發射光譜。一個常見的系統采用FAM,JOE,TAMRA和ROX四大染料(見表1)。

表1 ? 基于fluorescece測序中使用熒光染料; 它們的吸收(激發)和發射和顏色的波長

染料 最大。吸收波長/ nm的 最大。發射波長/ nm的 顏色
FAM 495 520 藍色
JOE 530 555 綠色
TAMRA 550 575 黃色
ROX 580 605

的片段通過電泳分離和熒光染料由激光激發。凝膠圖像然后可以由計算機進行分析和DNA序列產生。超過800個堿基可以在一個單一的凝膠泳道中讀出。DNA自動測序儀可以分析在單一凝膠(從一個凝膠76 800即約基地)96個不同車道,可以分析3凝膠,每天給人每天大約有230 400個堿基或每年超過50 000 000基地的吞吐量。機已經發展到同時分析384測序反應。其他最近的創新包括標有兩個熒光染料(“大染料化學”),雙脫氧三磷酸核苷的發展。一種染料(通常熒光素)在其λ的激發最大值在520nm處495處的結果中發射其通過FRET轉移到具有λ第二染料最大值接近520納米。第二染料在較高波長強烈熒光。這將產生比通過第二熒光染料的直接激發在495nm處可以得到更強的熒光信號。的進步也已經在凝膠技術制成。利用毛細管凝膠,而不是平板凝膠促進了樣和分析的自動化,提供更高的吞吐量。

熒光桑格(雙脫氧)測序

圖6 | 熒光桑格(雙脫氧)測序

新一代測序

人類基因組計劃完成了人類基因組的3比永堿基對的測序完成,在1990年和2003年之間的巨大協同努力的人類基因組計劃依靠的結果(盡管高優化和自動)Sanger測序。現在可以在幾天之內,以序列的整個人類基因組,由于采用了新一代統稱為下一代DNA測序測序技術的。

測序修飾的DNA

現有的DNA測序方法(包括下一代測序)是不能檢測修飾的堿基。與在感興趣的最近激增表觀遺傳學,未能胞嘧啶和5-甲基(這兩個構成沃森-克里克堿基對與鳥嘌呤)區分是當前的測序技術的一個嚴重的缺點。

亞硫酸鹽測序

亞硫酸氫鹽(HSO 脫氨非甲基化胞嘧啶向尿嘧啶,但不與甲基胞嘧啶(反應圖7)。這提供了含有5-甲基胞嘧啶堿基測序的DNA的方法。前和亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行測序:從胞嘧啶到尿嘧啶任何變化被歸因于非甲基化胞嘧啶,而被假定保持亞硫酸氫鹽處理后的胞嘧啶堿基的原始樣品中的被甲基化。

胞嘧啶重亞硫酸鹽轉化成尿嘧啶

圖7 | 胞嘧啶重亞硫酸鹽轉化為尿嘧啶亞硫酸氫鹽(HSO 非甲基化胞嘧啶轉換為尿嘧啶,但不轉換甲基胞嘧啶到胸腺嘧啶。

亞硫酸鹽測序

圖8 | 亞硫酸氫鹽測序的DNA測序用亞硫酸氫鹽處理之前和之后(HSO ),該脫氨非甲基化胞嘧啶堿基為尿嘧啶,允許確定DNA樣品的甲基化狀態。

市售重亞硫酸鹽轉化試劑盒使該過程例程,但它仍然是昂貴的:必須注意,所有未甲基化的胞嘧啶脫氨,并且每個DNA樣品必須(當然)進行測序兩次。

DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜是在上世紀80年代在英國萊斯特大學發明了亞歷克·杰弗里斯爵士。人DNA可通過該方法來分析在基因水平肯定比以前的法醫方法如血型判定或傳統指紋分析的遠較大程度來識別個人。DNA指紋(也稱為DNA分析,DNA分型或基因指紋)也可用于確定個體之間的關系(例如親子鑒定)。

DNA指紋圖譜迅速成為英國國家DNA數據庫,其中包含數以百萬計的個人檔案的技術基礎。現在是在檢測和罪犯定罪經常使用的主要資源,并產生數百每星期在犯罪現場發現的DNA匹配。短串聯重復序列的分析序列(STR)形成在世界各地使用法醫DNA分析系統的基礎。

短串聯重復序列

兩個隨機選擇的人的DNA的相差在1000個堿基左右1; 換句話說,我們是99.9%相同。正是這種相似性,使得適用于所有美國的“參考”人類基因組測序。我們的DNA的一定區域包含比其他的差異,和短串聯重復序列是DNA的一個區域呈現個體之間的大變化的一個例子。

DNA指紋取決于短串聯重復序列(STR),兩個或更多個核苷酸的短的重復模式(例如(的分析CAñ或(ACGTñ,其中Ñ是幾百)。例如,序列CGTCAG在CAC,所述二核苷酸的CA重復13次(Ñ = 13)。

數千種不同的短串聯重復序列,或幾十已在人類基因組中已經確定。可疑交易是在人口中的不同成員在染色體上的相同位置(基因座)觀察到的,但重復的次數(Ñ個體之間)變化。在重復次數這種變化的一個例子多態性

STR分析

STR分析使用PCR技術來測量在特定基因座的重復次數。引物結合于特定STR基因座的DNA和,通過PCR延伸。PCR產物的長度取決于重復的次數。如果PCR引物被標記,PCR產物將被標記,從而在反應結束時檢測出的產物。對于每個基因座,將有兩個PCR產物(每個兩個等位基因)。

多個不同的STR基因座的同時分析使個人的特有配置文件被建立起來。幾個PCR反應在不同的STR基因座單管同時進行,得到幾種產品(兩個用于每個基因座)。以下組件是必需的:

  • DNA樣本,例如從犯罪現場一個人的頭發,或從犯罪嫌疑人的嘴湊口腔細胞
  • 兩種寡核苷酸PCR引物:標記在5'端用一個引物32 P,和一種未標記的反向引物
  • 熱穩定DNA聚合酶
  • 四脫氧核苷三磷酸:的dATP,dGTP,的dCTP,dTTP的。

當標記的PCR產物在聚丙烯酰胺凝膠上運行,它們根據大小分離。結果是一個“DNA梯子”,即一個單獨的(的特性圖9)。

DNA指紋通過STR分析

圖9 | DNA指紋圖譜通過STR分析短串聯重復序列(STR),二,三或重復幾次,四核苷酸單位在每個人的基因組中存在。當通過PCR使用標記的引物擴增中,產生不同長度的標記的DNA片段。這些片段通過凝膠電泳或毛細管電泳分離,得到的個體的獨特的DNA“條形碼”。

使用多個位點提供了一個非常高度的確定性,在人口不兩個個體將具有相同的輪廓(除非它們是同卵雙胞胎)。一些當前法醫系統使用10(如英國)或13(例如,美國)的STR基因座。含有PCR引物的標準STR基因座的試劑盒在市場上銷售。

熒光STR分析

在STR分析的更現代的變型中,PCR引物標記有熒光染料。對于不同的STR基因座的引物標記有不同的熒光染料,增加第二維度的測定(圖10)由于其迄今可能開發只具有良好分辨的光譜特性,三種不同的熒光染料的熒光染料的數量有限通常使用。

熒光STR分析

圖10 | 熒光STR分析在熒光STR分析,PCR引物是熒光標記的,這導致熒光標記的PCR產物。利用不同的熒光標記的是指從不同的STR基因座始發的產品和頻帶可以更容易辨別。

親子鑒定

在親子糾紛STR分析

圖11 | 在親子STR分析爭議的親子糾紛(使用3個STR位點)使用STR(短串聯重復)分析的一個簡單的例子。在STR波段的一半來自母親,一半來自父親。某些頻段是從母親和父親都繼承。如果孩子的DNA圖譜包含所有存在既不是母親,也不是所謂的父親的DNA圖譜帶,那么所謂的父親不是孩子的親生父親。如果在這個例子中涉嫌的父親被指示支付子女撫養費?

單核苷酸多態性(SNP)

突變發生在DNA為在錯誤的結果,DNA的復制和化學損壞。這些突變具有潛在危害的生物體,和一組DNA修復機制存在扭轉他們。多態性是在一個DNA序列被建立并在人口穩定的,并且不有害的變化。有兩個或更多個同樣可接受的替代品,其中一個恰好是比其他人更常見。在一般情況下,如果一個變化已在人口的1%或更多的頻率,它是一個多態而非突變。

單核苷酸多態性(SNPs,顯剪刀)是多態性在人類基因組中最常見的類型。之一的兩個特定堿基(等位基因)將發生在一個SNP位點; 例如,A將發生在人口的一些成員,而在其他-G。單核苷酸多態性發生每1000個堿基對約一次,構成本體的3×10的6在基因組中的變化,并傾向于在人口保持穩定。單核苷酸多態性發生在基因以及在控制基因表達的基因組的周圍區域。

一個特定的SNP的一個等位基因上的基因的作用可能并不大 - 也許影響在一個微妙的方式所編碼的蛋白質的活性 - 但即使微妙的影響可以影響易感性常見的疾病,如冠狀動脈血栓形成或阿爾茨海默氏病。通過在疾病的已知患者研究大量的SNP能夠確定疾病是否有遺傳鏈路。在這種情況下,個人數字越大研究,遺傳鏈路出現的可能性越大。一旦這樣的鏈接被發現,在人口感染該病的任何個體的易感性可以預測的。SNP分析可能發揮在醫藥和診斷對未來的影響力越來越大的作用; 例如,在預測個體對藥物的反應,使相應的處理,可以規定(藥理學)。

在許多個SNP的兩個等位基因有關于在人群中的頻率相同,即如果可以發生在一特定基因座的兩個堿基是A和G,一半人口將具有腺嘌呤,而另一半將具有鳥嘌呤。顯然還沒有進化壓力有利于在這些基因座的等位基因的一個或另一個。這些種類的SNP的是在遺傳分析非常有用的。相反,如果發生在一個非常低的水平的等位基因,所述SNP是作為分析工具有用要少得多,因為它會被很少遇到。因此,在DNA已經從大量個體(例如,從一組人患心臟疾病)的合并,這將是很難檢測的次要等位基因的存在,即使是這一組中超過限額相對于未患有疾病的一組。

單核苷酸多態性的分析還可以提供關于物理特征的信息。這方面的一個例子是眼睛的顏色先試商用(Retinome™)。除了眼睛的顏色,單核苷酸多態性已與人類表型的其他功能,如頭發和皮膚的顏色聯系起來。大量的表型的SNP分析,相當于建造一個單獨的“并圖”的畫面,因此是一個功能強大的伴奏STR分析法醫調查員。在分析的SNP的挑戰是等同于分析為單點突變的DNA,如基因多態性和基因突變的現象有關。

DNA診斷和突變檢測

DNA診斷涉及與特定疾病相關的基因組或線粒體DNA的區域的鑒定和分析。通常該DNA序列將負責一個有缺陷的蛋白質的表達,但它也可以是控制基因表達的區域。當這種DNA序列已被確定,它的個體的DNA樣品中存在(或不存在)必須確定。的突變DNA篩查取決于的靈敏,快速,準確和經濟程序的發展,其中PCR擴增結合使用與適當的探針技術(實時PCR)。

基于DNA的探針的技術,可用于檢測小至單個核苷酸取代,插入和缺失突變的差異。這樣的點突變可以引起的遺傳性疾病,如鐮狀細胞性貧血,囊性纖維化,苯丙酮尿癥和亨廷頓氏病。遺傳分析是很重要的預先和產后診斷,遺傳信息也可以被用于個人的易感性預測外源性風險,如飲食或環境因素。傳染病如麻疹,風疹,艾滋病毒,甲型和乙型肝炎,和由病原生物體如疾病沙門氏菌念珠菌,可以使用DNA探針技術進行診斷。某些寡核苷酸基于探針的技術是足夠的選擇性密切相關的有機體/病毒區分,如1型和單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)的2變體。

實時熒光定量PCR

實時PCR是對結合的DNA的正常PCR擴增與PCR產物的同時檢測,通常是在一個反應??管中的PCR主題的變化。在PCR中,雙鏈DNA的量與每個循環增加。的PCR的多次循環后,存在的DNA的量的大量增加。在實時PCR(也稱為定量PCR,或定量PCR),結合于雙鏈DNA被加入到PCR反應的試劑。作為雙鏈DNA產生,所述試劑結合到新合成的DNA,并產生使反應實時監視的信號。同時PCR的目的是DNA的擴增,實時PCR的目的是DNA樣品或反應的分析。

熒光實時PCR是PCR擴增和熒光檢測的組合。在其最簡單的形式中,熒光實時PCR包括使用的有機染料,只有當結合到DNA雙鏈體是熒光的。當這樣的染料是在PCR反應開始時加入發生熒光的增加作為DNA的數目雙鏈增加,并且這是指示成功的PCR。的SYBR Green(圖12)是結合雙鏈DNA,并成為對結合(雙鏈DNA染料配合物是熒光)的熒光的分子的一個例子。

的SYBR Green

圖12 | 的SYBR Green 的SYBR Green I,結合于雙鏈DNA的熒光分子的結構。

的SYBR綠實時PCR方法具有嚴重的局限性,因為它是無特異性,即無論是獲得的PCR產物的性質的陽性結果。作為PCR是容易發生偽影,例如引物二聚體的形成,使用非選擇性染料簡單擴增并不總是非常豐富,并基于探測的方法提供更有意義的結果。

基于探針實時熒光定量PCR

當在人的診斷使用PCR它是某些產品的確切性質是重要的。在PCR產物(擴增子)鍵序列的鑒定可以通過加入熒光DNA探針來實現(一個短的合成寡核苷酸,其是在PCR擴增子的特定序列互補,并且不發出熒光,除非它結合到擴增子)在PCR反應。幾種不同類型的探頭滿足這些標準,這些將在下面詳細討論。

當DNA探針在實時PCR中使用,只有在PCR擴增子中包含的互補的序列的熒光探針獲得肯定信號:熒光信號是序列特異性的。例如,臨床樣品可以為導致囊性纖維化基因被測試如下:a探針是囊性纖維化基因(目標)的突變區域互補合成和PCR是在此存在對樣品進行探測。在PCR擴增過程中的DNA分子(PCR擴增子)的數量增加而增加。如果突變存在時,探針 - 靶雜交體的濃度也增加,熒光信號生長在可預測的方式,表明突變的基因確實存在。但是,如果不產生熒光信號,這表明該患者不攜帶特定突變。在實際的臨床應用兩個突變體和野生型探針并行使用。患這種病的人,將給予從突變探頭一個積極的信號,而未受影響的人將給予從野生型探針一個積極的信號。本病的攜帶者可能給來自兩個探頭一個積極的信號。

專門的設備是必要的熒光實時PCR和許多文書已設計用于此目的。它們都包括一個熱循環儀來驅動PCR反應中,一個光源,以激發熒光染料(s)和一個熒光檢測器,用電腦來控制儀器和處理數據一起。

在一般的“熒光”探針含有熒光染料和淬滅熒光。它們是在不存在靶核酸的非熒光因為猝滅劑從激發熒光團吸收的能量,并且該能量在較高波長作為熱量耗散或輻射。還有的熒光淬滅兩個獨立的機制:碰撞淬火FRET淬火

該TaqMan方法

所述的TaqMan測定法是用于PCR產物的分析使用最廣泛的實時的方法,并在SNP分析和突變檢測廣泛使用。TaqMan探針是由在一端用熒光團標記的寡核苷酸,例如5'-FAM(5'-熒光素),并在另一淬滅劑的熒光,例如3'-TAMRA的。在495處其吸收波長熒光的激發通常會導致熒光發射在525nm。然而,這落在TAMRA染料是在TaqMan探針接近的寬吸收光譜范圍內,所以能由TAMRA染料由于熒光共振能量轉移(FRET)被吸收和熒光在TAMRA的發光波長觀察(585納米),而不是在FAM的發射頻率。

所述的TaqMan方法描述圖13,在每一個冷卻循環之前,伸展相,TaqMan探針雜交的PCR擴增子的互補序列。當Taq聚合酶聚合過程中遇到該TaqMan探針,酶的5'至3'外切酶活性將導致探針的消化。這在495納米分離受體(TAMRA)和激發熒光體(FAM),現在帶領由FAM在525納米至熒光發射。從FAM沒有能量傳遞給TAMRA現在可以發生,因為這兩種熒光染料相距甚遠。因此,當TaqMan探針已被消化的TAMRA染料不發熒光。總體而言,在525nm處的增加的熒光發射,并在585下降(nm)是指示陽性PCR反應,并且重要的是證實了正確的擴增子的存在。其他熒光染料可以在TaqMan探針可以使用,只要它們具有合適的熒光發射和吸收光譜。

該TaqMan方法

圖13 | 的TaqMan分析

熒光共振能量轉移(FRET)

所述的TaqMan測定法利用熒光共振能量轉移(FRET),已被廣泛用作光譜“尺子”,以檢查的DNA二級結構的有力工具。在FRET中,激發的熒光團(能量供體)其能量通過誘導偶極-偶極相互作用時的偶極子是在大致平行的方向傳送到相鄰的發色團或熒光團(受體)非輻射。對于發生FRET必須有供體的發射光譜和受體的吸收光譜之間的重疊。供體和受體之間的能量轉移的效率是成反比的兩種熒光團(1 /之間的距離的第六功率6)。的最佳距離(?為能量的非輻射轉移)為10-100埃之間為最常用的熒光團。

熒光猝滅機制

圖14 | 熒光猝滅機制

見一節FRET淬滅劑的信息,具體的FRET淬滅劑,如BHQs。

分子信標

分子信標是一個化學修飾的寡核苷酸,采用在不存在互補靶序列的莖-環結構。該環路由一個旨在雜交PCR過程中擴增子的特定序列的探針,和桿構成的兩個短的互補寡核苷酸,其中一個標用熒光團和其他與非熒光猝滅劑。在莖-環的形式中,熒光團和猝滅劑在非常靠近由短雙鏈體結構保持,并且,如果所述熒光團被激發,能量被猝滅劑吸收,并且作為熱量耗散(非輻射能量轉移)。這是在分子信標(的“封閉”或“暗”狀態。圖15,上圖)。

在PCR中的每個循環,在變性步驟中,打開的分子信標的莖環(即在干游離的堿基對或“融化”)。在隨后的冷卻(退火)階段,分子信標的環路雜交在擴增子的互補序列,從而形成一個短雙鏈體。在這種形式(“開放”的形式)的莖離得太遠,聯想,熒光團和淬滅劑保持分開,并且照射產生的熒光信號(圖15,下圖)。在實時PCR,熒光必須在在該信標中的莖環形式是穩定的(通常約50℃)的溫度下進行測量,以使未雜交探針不產生不希望的背景熒光。

分子信標

圖15 | 分子信標

最初,分子信標被設計用在5'末端的熒光團5-(2'-氨基乙基) -氨基萘-1-磺酸(EDANS)和熒光猝滅劑的4-(4'- dimethylaminophenylazo)苯甲酸(DABCYL)在3'末端(圖16)。

DABCYL和EDANS

圖16 | DABCYL和EDANS 熒光淬滅DABCYL和熒光EDANS的結構。

最近,更廣泛的熒光團已用相同DABCYL猝滅一起使用。碰撞熒光淬滅是在封閉的形式非常有效的,并且不上淬滅劑的吸收光譜強烈依賴。然而,熒光的開放形式的水平是有限的熒光團和猝滅劑保持相對彼此接近。

分子信標可以用來通過測量熒光的強度在每個PCR循環(定量PCR)退火階段量化擴增子的PCR過程中的濃度。他們也已經在SNP和突變分析廣泛使用。幾個分子信標,每一個獨特的熒光團,可以在多重PCR反應中用于同時分析在不同基因座的單核苷酸多態性。

蝎子引物

蝎子是PCR引物附著(通過接頭)一個分子信標充當PCR塞子。這個連接體,通常六乙二醇,隔離底漆的信標部分。蝎子的引物部分的PCR延伸后,將所得的擴增子中包含的序列是探針部分互補。在PCR循環的變性階段擴增子呈現單鏈和冷卻所述探針元件結合到這種補體,以形成分子內雙鏈體。在這種形式的猝滅劑不再位于接近熒光團和熒光信號產生(圖17)。

圖17 | 蝎子引物

蝎子探針含有在單個寡核苷酸幾種化學修飾,因此是相對復雜的分子來合成。然而,它們具有比分子信標一些主要的優點。PCR過程中的活性蝎的形成是一個分子內的過程,因此,比使用分子信標發生等效的分子間反應快得多。此外,蝎子的活性形式是比分子信標,這往往脫落他們的目標,并折疊成非熒光分子內發夾環的動力學更加穩定。在對比TaqMan探針,蝎子不取決于酶裂解以產生熒光信號,和高速PCR循環因此可能的,從而導致非常快速而可靠的檢測系統。

其它診斷方法

DNA微陣列

寡核苷酸可以化學附著到材料如玻璃或硅的表面,在其上它們形成小的大約100微米的“點”(10 -4直徑米)。寡核苷酸的大量可在單個幻燈片中加以規定,以形成微陣列,和熒光標記的DNA(標記的PCR產物或cDNA)的單鏈可通過雜交捕獲。(基因是單鏈DNA,以從它是由合成的RNA互補的反轉錄,它給出了在細胞(表達分析表達的各種RNA消息)的性質間接信息)。如果這樣的微陣列包含1000點則在理論上是可能的雜交一個唯一的互補核酸序列的每個點。的DNA序列的同一性,從光點的位置與它雜交使用熒光掃描儀推斷。

附連到捕獲的核酸鏈的熒光標記物可以用許多不同的方法加入。PCR產物可以在5'末端簡單地通過使用含有5'-熒光染料PCR引物進行標記。PCR引物可以與多個熒光團進行標記,但是這些往往以猝滅彼此并且還抑制了PCR反應。一種更好的方式來介紹多個標簽到PCR產物是在PCR使用熒光標記的脫氧核苷三磷酸或逆轉錄酶反應(例如熒光素標記的dT)。然而,在PCR反應的效率可以通過該雜環基,其可以抑制Taq聚合酶上的化學修飾受到損害。一個精心確定未標記和標記的脫氧核苷三磷酸的混合物,因此必須使用,并且這是罕見實現標記的密度大于每30個核苷酸1熒光更大。微陣列測定,也可以由個別的PCR產物附著到滑動作為離散斑點,并與熒光標記的寡核苷酸(池探測在反向格式進行圖18)。

DNA微陣列

圖18 | DNA芯片

因為DNA鏈的非常大的數字,可連接到單個陣列DNA微陣列是高通量突變,SNP和基因表達分析是有用的。微陣列是由適合機器人系統自動化,允許非常高的吞吐量。然而,他們目前由于對表面分子的一些不良化學和生物物理特性的挑戰。首先,它難以形成非常密集陣列。100μm的點尺寸是可以實現的,但較小的斑點(例如1微米)將允許每個陣列的斑點的高得多的號碼,允許使用溶液相DNA和更大的吞吐量的較小體積的。其次,互補DNA分子的一個表面上的雜交是幾乎沒有溶液雜交效率高。為了使系統可行,表面的性質和表面和附著的DNA之間的連接體的性質,必須仔細控制。

熒光原位雜交(FISH)

原位雜交(ISH),其允許特定的DNA序列的使用放射性標記染色體的識別和可視化,在討論的合成和化學修飾的寡核苷酸的應用熒光原位雜交(FISH),其中通過采用基于熒光的檢測和可視化通過熒光顯微鏡延伸ISH,是在遺傳分析的重要工具。FISH的原理在于標記探針的退火以固定的細胞或組織的染色體內的互補鏈,隨后通過檢測熒光標記的。探針(DNA或RNA)通常由三個聚合酶基于酶的方法中的一種(切口平移,隨機引物或PCR),其允許熒光標記的脫氧核苷三磷酸的摻入制備。每30個核苷酸一種熒光標記的平均摻入水平是典型的。的DNA探針的長度可以是100 bp和1000bp的間。較長的探針增加的非特異性背景熒光,但短探針是很困難的,由于雜交不足和標簽低水平來檢測。重要的是目標為在探頭訪問,必須在原位,而不是由核酸酶降解被保留。可視化限制從整個染色體為40 kb的染色體區段跨越。

熒光原位雜交已經用于識別染色體內的基因的位置(雖然這是與人類基因組的測序不太有用),染色體“畫”,用于可視化整個染色體的技術,并在表征和診斷疾病。